非洲豬瘟的致死率令養(yǎng)殖場(chǎng)措手不及，侵入豬身體里的病毒為什么可以長(zhǎng)驅(qū)直入？有沒(méi)有什么辦法能夠阻止它的入侵呢？

       日前，我國(guó)復(fù)旦大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、遺傳工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室甘建華課題組與李繼喜課題組合作，研究解析了非洲豬瘟病毒DNA修復(fù)通路上一種關(guān)鍵酶的結(jié)構(gòu)。相關(guān)研究成果在線(xiàn)發(fā)表于《自然·通訊》。

       這種關(guān)鍵酶是連接酶，被稱(chēng)為基因“針線(xiàn)”，用于將不同的DNA片段連接起來(lái)。這次通過(guò)解析非洲豬瘟病毒DNA連接酶的分子機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)找到了非洲豬瘟病毒的保守位點(diǎn)，為針對(duì)非洲豬瘟病毒DNA修復(fù)通路蛋白的藥物設(shè)計(jì)提供了結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

       斷尾求生，病毒躲過(guò)宿主免疫系統(tǒng)

       “人們會(huì)發(fā)現(xiàn)，患了豬瘟的病豬會(huì)發(fā)生脾 臟腫大，脾 臟是重要的免疫器官，那說(shuō)明它的免疫系統(tǒng)‘奮力作戰(zhàn)’了。”李繼喜說(shuō)，但是非洲豬瘟病毒很聰明，在進(jìn)入體內(nèi)后會(huì)不斷變化，讓免疫系統(tǒng)“抓不到”。

       它的變化很像壁虎的“斷尾求生”。“對(duì)于宿主免疫系統(tǒng)要攻擊的DNA片段，它會(huì)剪切掉，然后再重新‘長(zhǎng)出來(lái)’。”李繼喜說(shuō)。“長(zhǎng)出來(lái)”意味著DNA的延長(zhǎng)、重組，這個(gè)過(guò)程需要兩種DNA聚合酶（X和P）和一種DNA連接酶。

       “有這3種酶參與的整個(gè)過(guò)程形成了一套完整的DNA修復(fù)通路。”李繼喜說(shuō)，團(tuán)隊(duì)已經(jīng)解出了其中的一種聚合酶，文章2017年發(fā)表，揭示了聚合酶X擁有一個(gè)獨(dú)特的磷酸根識(shí)別位點(diǎn)；另一種聚合酶的研究已經(jīng)收尾，正在進(jìn)行結(jié)果整理和論文編寫(xiě)工作，至此團(tuán)隊(duì)已經(jīng)“全面打通”整個(gè)通路的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)。

       病毒更狡猾的地方在于它新長(zhǎng)出來(lái)的DNA片段和原來(lái)的不同，使得宿主體內(nèi)的免疫系統(tǒng)措手不及，難以鎖定攻擊目標(biāo)。非洲豬瘟病毒也是如此，其基因組修復(fù)時(shí)會(huì)發(fā)生突變，讓免疫系統(tǒng)無(wú)法精準(zhǔn)識(shí)別，進(jìn)而使得針對(duì)它們的狙擊，無(wú)法奏效。

       分辨率高，晶體法定格“繡娘”手法

       俗話(huà)說(shuō)，“萬(wàn)變不離其宗”。既然病毒DNA修復(fù)時(shí)有千變?nèi)f化，有沒(méi)有可能找到所謂的“宗”即保守區(qū)呢？

       這就要對(duì)關(guān)鍵酶進(jìn)行高精度的結(jié)構(gòu)解析。團(tuán)隊(duì)選擇了X-射線(xiàn)晶體學(xué)方法，與聲名鵲起的冷凍電鏡方法相比，前者的分辨率更高，且一旦摸索好條件后，更易重復(fù)。

       結(jié)晶條件的摸索卻是非常艱難的過(guò)程。“我們用基因工程的方法，讓非洲豬瘟病毒的連接酶在工程菌中大量表達(dá)，通過(guò)純化柱等方法將蛋白純化出來(lái)。”李繼喜說(shuō)。這個(gè)時(shí)候目標(biāo)蛋白還在溶液中，與同自己性質(zhì)、分子量相近的“兄弟姐妹”在一起。

       團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了上千次相關(guān)參數(shù)的摸索，最終得到了均一性高的**晶型，通過(guò)X光衍射、三維重構(gòu)等方法，獲得了分辨率達(dá)到2.5埃的連接酶分子結(jié)構(gòu)。

       在超高分辨率下，科學(xué)家可以看到蛋白質(zhì)中每個(gè)氨基酸單體的相互作用、電子密度云的情況，目擊氫鍵間的相互連接，從而判斷和預(yù)測(cè)作為“繡娘”的DNA連接酶將用哪些可能的針?lè)▽⑹裁礃拥腄NA片段連接起來(lái)。

       親見(jiàn)“凹造型”，鎖定藥物設(shè)計(jì)潛力點(diǎn)

       預(yù)測(cè)之后，必須親見(jiàn)。利用X-射線(xiàn)晶體學(xué)方法獲取酶與DNA作用的“影像”，將對(duì)酶與底物相互作用時(shí)的“凹造型”一目了然。

       為此，根據(jù)已經(jīng)獲得的連接酶分子結(jié)構(gòu)，參考相關(guān)文獻(xiàn)，團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了10幾種可能的DNA片段，試試連接酶的“功力”。“DNA片段有長(zhǎng)有短，含有的堿基對(duì)數(shù)量8到20個(gè)不等。”李繼喜說(shuō)。

       對(duì)于這些不同的DNA底物分子，連接酶表現(xiàn)了不同的活性。從本質(zhì)上說(shuō)，它們之間的反應(yīng)是酶促反應(yīng)。分析發(fā)現(xiàn)，非洲豬瘟病毒連接酶在底物催化位點(diǎn)附近具有一些明顯不同的氨基酸組成。蛋白突變、體外DNA結(jié)合以及活性研究顯示，催化位點(diǎn)附近的氨基酸對(duì)其與DNA形成復(fù)合物及活性至關(guān)重要。

       李繼喜解釋道：“單獨(dú)的酶的構(gòu)象可以想象成一個(gè)三節(jié)棍，當(dāng)和DNA作用時(shí)，這個(gè)三節(jié)棍的三段會(huì)發(fā)生變化，收攏到一起形成一個(gè)‘口袋’狀，把DNA關(guān)在里面，促成DNA連接反應(yīng)的進(jìn)行。”

       高分辨率結(jié)構(gòu)顯示，該連接酶在N-端具有一個(gè)獨(dú)特的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（NTD），該結(jié)構(gòu)域?qū)Φ孜锝Y(jié)合十分重要。

       “這就好比‘口袋’入口的地方有個(gè)把門(mén)的，這個(gè)獨(dú)特的結(jié)合結(jié)構(gòu)域‘認(rèn)可’了，才能被連接酶納入到口袋中，促進(jìn)DNA的反應(yīng)，如果這個(gè)‘把門(mén)’的不同意，就無(wú)法進(jìn)行DNA的‘縫合’工作。”李繼喜說(shuō)。

       可以針對(duì)這個(gè)獨(dú)特的位點(diǎn)設(shè)計(jì)藥物，阻斷連接酶的工作，進(jìn)而掌握抑制病毒的方法。“已有研究發(fā)現(xiàn)病毒的成熟顆粒中含有連接酶，也就是說(shuō)病毒已經(jīng)進(jìn)入了宿主細(xì)胞，并進(jìn)行了翻譯和組裝之后，才會(huì)啟動(dòng)連接酶的翻譯工作。”李繼喜說(shuō)，因此以該位點(diǎn)為靶點(diǎn)的藥物并不能預(yù)防非洲豬瘟的感染，而是對(duì)豬瘟進(jìn)行治療。目前，該團(tuán)隊(duì)已經(jīng)開(kāi)始與北大團(tuán)隊(duì)合作開(kāi)啟化合物的篩選工作。