殺菌劑的抗性現(xiàn)狀、抗性類型和抗性機(jī)制

       1.苯基酰胺類殺菌劑

       （1）抗性現(xiàn)狀

       苯基酰胺類殺菌劑主要包括甲霜靈、苯霜靈和惡霜靈，其中甲霜靈應(yīng)用最為頻繁和普遍，抗藥性的研究與監(jiān)測(cè)也最為深入透徹。甲霜靈最早于1970年被引入作為系統(tǒng)殺菌劑防治卵菌病害，被廣泛用于防治致病疫霉和霜霉所引起的病害。1978年以色列用該藥防治黃瓜霜霉病，一年后，經(jīng)檢測(cè)病菌對(duì)甲霜靈的抗藥性水平高達(dá)500倍以上。Sun等采用傳統(tǒng)葉盤法檢測(cè)了2007-2008年間我國(guó)7省11個(gè)地區(qū)葡萄霜霉病菌對(duì)甲霜靈的抗藥性，結(jié)果顯示，392菌株中有13%為敏感菌株，26%表現(xiàn)為低抗，61%為高抗，可見國(guó)內(nèi)葡萄霜霉菌對(duì)甲霜靈已普遍產(chǎn)生抗藥性。

       （2）抗性類型和抗性機(jī)制

       該類殺菌劑的主要作用方式是抑制蛋白質(zhì)及RNA的生物合成，特異性地抑制核糖體RNA聚合酶Ⅰ的活性，對(duì)植物病害的各主要生長(zhǎng)階段如菌絲生長(zhǎng)、吸器形成及孢子囊產(chǎn)生均具有很好的抑制作用。

       大量的研究表明，卵菌對(duì)甲霜靈的抗藥性是由單個(gè)主效基因控制的質(zhì)量遺傳性狀，但病菌基因組中的抗性相關(guān)基因和抗性突變位點(diǎn)目前還尚不明確。2014年Randall等報(bào)道，甲霜靈的抗性與編碼RNA聚合酶Ⅰ大亞基RPA190基因單核苷酸多態(tài)性SNP T1145A位點(diǎn)的突變相關(guān)，T和A分別代表敏感和抗性兩種類型，當(dāng)該位點(diǎn)的堿基T突變?yōu)锳時(shí)會(huì)造成絡(luò)氨酸被苯丙氨酸替代，最終導(dǎo)致RPA190等位基因由抗藥型變?yōu)槊舾行汀?015年Michael通過DNA測(cè)序、SNP和高分辨率溶解曲線（HRM）試驗(yàn)證明，RPA190等位基因的SNP T1145A位點(diǎn)的變化與甲霜靈抗藥性的變化不一致，指出用RPA190基因的變化不能夠充分診斷田間菌株對(duì)甲霜靈的敏感性水平。

       2.甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑

       （1）抗性現(xiàn)狀

       甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑是一類能有效控制子囊菌、擔(dān)子菌、半知菌和卵菌為害的廣譜性殺菌劑。其代表藥劑為嘧菌酯，主要作用是抑制孢子萌發(fā)，游動(dòng)孢子的釋放和游動(dòng)，對(duì)病害無治療作用。該類藥劑于1996年進(jìn)入市場(chǎng)用于防治小麥白 粉病，兩年后在德國(guó)北部3個(gè)地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)了抗QoI類殺菌劑的抗性菌株，抗性倍數(shù)大于500，抗藥性菌株在群體中的頻率高達(dá)90%。張艷菊等測(cè)定了我國(guó)8個(gè)省份13個(gè)黃瓜主產(chǎn)區(qū)霜霉菌對(duì)嘧菌酯的抗藥性，結(jié)果顯示無高抗菌株的存在，其中山東省菌株對(duì)嘧菌酯的抗性水平，其他省份抗性水平相對(duì)較低。

       （2）抗性類型和抗性機(jī)制

       嘧菌酯是一種高選擇性單一位點(diǎn)抑制劑，其通過與線粒體呼吸鏈中細(xì)胞色素bc1復(fù)合物中的Qo位點(diǎn)結(jié)合，從而達(dá)到阻礙電子傳遞，影響線粒體的呼吸作用。大量的試驗(yàn)表明，甲氧基丙烯酸酯類殺菌劑的抗藥性屬于質(zhì)量遺傳抗藥性，在大多數(shù)病原菌中，細(xì)胞色素b基因中存在兩種主要的突變導(dǎo)致產(chǎn)生抗藥性，分別為143位甘氨酸被丙氨酸替代和129位苯丙氨酸被亮氨酸替代（G143A、F129L），143位甘氨酸被丙氨酸替代這種情況最為普遍。在對(duì)細(xì)胞色素b基因143位氨基酸突變的研究中發(fā)現(xiàn)，從遺傳學(xué)角度看存在4種主要的單倍型差異，這表明葡萄霜霉菌群體抗性至少存在兩種不同的起源。在法國(guó)霜霉菌抗藥性檢測(cè)中單倍型I（IS、IR）和單倍型II（IIS、IIR）的抗性頻率分別達(dá)到了75%和25%，并且這種分布差異很大。

       3.羧酸酰胺類殺菌劑

       （1）抗性現(xiàn)狀

       羧酸酰胺類殺菌劑是生產(chǎn)上用于替代苯基酰胺類殺菌劑，為緩解甲霜靈藥劑的抗藥性而研發(fā)的一類結(jié)構(gòu)新穎的藥劑。烯酰嗎啉是該類藥劑中最早研發(fā)成功的一種，20世紀(jì)80年代由美國(guó)氰氨公司研發(fā)并投入市場(chǎng)，對(duì)霜霉病和晚疫病有。1994年，Albert等報(bào)道在法國(guó)地區(qū)出現(xiàn)了對(duì)該藥劑敏感性降低的葡萄霜霉病菌群體。2005年，在法國(guó)的東西南部等多個(gè)地區(qū)相繼監(jiān)測(cè)到對(duì)烯酰嗎啉敏感性下降的病菌，但抗藥性頻率都較低，并且抗性群體的比例隨地區(qū)和年份的不同波動(dòng)很大。在中國(guó)，2010年Sun等對(duì)采自全國(guó)7省11個(gè)地區(qū)采集的葡萄霜霉菌進(jìn)行烯酰嗎啉敏感性測(cè)定，未發(fā)現(xiàn)抗性菌株。王喜娜等報(bào)道在2015年廣西資源縣的葡萄霜霉病菌株中發(fā)現(xiàn)了對(duì)烯酰嗎啉具有抗藥性的菌株，這是國(guó)內(nèi)首次關(guān)于葡萄霜霉病菌對(duì)烯酰嗎啉具有抗性的報(bào)道。

       （2）抗性類型和抗性機(jī)制

       該類殺菌劑能夠抑制病原菌的菌絲生長(zhǎng)、孢子囊及休止孢的萌發(fā)、卵孢子或孢子囊的形成，但是對(duì)游動(dòng)孢子的游動(dòng)、釋放以及休止孢的形成無抑制作用。烯酰嗎啉為該類殺菌劑的代表，其作用機(jī)制是破壞病菌細(xì)胞壁膜的形成，引起孢子囊壁的分解，而使病菌死亡。

       生物學(xué)試驗(yàn)研究表明病原菌對(duì)烯酰嗎啉的抗藥性主要與纖維素合酶基因1105位點(diǎn)堿基突變有關(guān)，大量的試驗(yàn)表明，病菌自然狀態(tài)下纖維素合酶PcCesA3基因在1105位的密碼子為GGC，編碼甘氨酸（GLy），在接觸大量的烯酰嗎啉藥劑后，該位點(diǎn)已發(fā)生堿基突變，由原來的GGC突變?yōu)锳GC編碼絲氨酸（Ser）或者突變?yōu)镚TC編碼纈氨酸（Val）。并且發(fā)現(xiàn)在所有對(duì)烯酰嗎啉敏感的菌株中，在1105位點(diǎn)編碼的氨基酸為GLy/GLy，GLy/Val，GLy/Ser，而在抗烯酰嗎啉的菌株中，在病菌的纖維素合酶PcCesA3基因的1105位點(diǎn)編碼的氨基酸為Ser/Ser，Val/Val，Ser/Val。即只有病菌在該位點(diǎn)發(fā)生純合突變，病菌才會(huì)由原來的對(duì)烯酰嗎啉敏感轉(zhuǎn)變?yōu)榭剐?，雜合突變只是抗性攜帶者并不表現(xiàn)為抗性。

       4.氰基乙酰胺類殺菌劑

       （1）抗性現(xiàn)狀

       霜脲氰，是20世紀(jì)70年代末被研發(fā)并廣泛應(yīng)用于葡萄園內(nèi)的一類系統(tǒng)防治卵菌病害的殺菌劑。霜脲氰對(duì)霜霉病和晚疫病有，有相當(dāng)長(zhǎng)一段時(shí)間，霜脲氰被為是一類具有低風(fēng)險(xiǎn)抗性的殺菌劑。然而，自20世紀(jì)90年代起，抗性菌株在意大利北部的兩個(gè)葡萄園中被檢測(cè)到。Sujkowski 等測(cè)定了來自墨西哥中部和北部的75個(gè)在遺傳上具有多樣性的致病疫霉菌株對(duì)霜脲氰的敏感性，結(jié)果表明各菌株對(duì)霜脲氰均表現(xiàn)敏感，且菌株間差異很小。霜脲氰自20世紀(jì)90年代初開始在中國(guó)大量使用，大部分地區(qū)的用藥歷史在10年以上。羅赫榮等用亞硝基胍誘變辣椒疫霉（P. capsici）的游動(dòng)孢子，篩選出29株抗甲霜靈、6株抗霜脲氰的突變菌株，并證明突變菌株的抗藥性經(jīng)無性和有性生殖均可穩(wěn)定遺傳。生產(chǎn)上，霜脲氰主要是同其他殺菌劑一起混合使用，很少單一使用，這在一定程度上降低了病原菌對(duì)其產(chǎn)生抗藥性的機(jī)率。

       （2）抗性類型和抗性機(jī)制

       霜脲氰對(duì)病菌的各個(gè)生命活動(dòng)進(jìn)程均有影響，孢子囊萌發(fā)以及游動(dòng)孢子釋放游動(dòng)等一系列生物學(xué)試驗(yàn)證明，霜脲氰在核酸和氨基酸的生物合成等一些二級(jí)反應(yīng)過程發(fā)揮重要作用。另一方面霜脲氰對(duì)DNA合成過程的影響明顯大于RNA合成的影響，但主要的作用位點(diǎn)、作用機(jī)制目前仍是未解之謎。

       5. 磺胺咪唑類殺菌劑

       （1）抗性現(xiàn)狀

       該代表藥劑為氰霜唑，作為對(duì)卵菌綱病害有的一款藥劑，氰霜唑?qū)λ共?、疫病有良好的效果，并且與市場(chǎng)上的苯酰胺類、羧酸酰胺類殺菌劑無交互抗性。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)氰霜唑抗藥性的研究相對(duì)較少。2012年，Jackson等通過對(duì)美國(guó)喬治亞州辣椒疫霉對(duì)氰霜唑、雙炔酰菌胺和烯酰嗎啉三種藥劑的混劑的抗藥性進(jìn)行檢測(cè)，在三種藥劑單獨(dú)使用的情況下，通過菌絲生長(zhǎng)、孢子萌發(fā)等方法檢測(cè)菌株抗藥性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株對(duì)雙炔酰菌胺和烯酰嗎啉均較敏感，而對(duì)氰霜唑已產(chǎn)生一定程度的抗藥性，菌絲生長(zhǎng)法和孢子萌發(fā)法測(cè)定結(jié)果顯示其最小抑制濃度（MIC）已達(dá)500 μg/mL，但混合物對(duì)孢子的萌發(fā)有很高的抑制作用，其平均 EC50 值僅為 0.04 μg/mL，可見氰霜唑單獨(dú)使用抗藥性風(fēng)險(xiǎn)較高。

       （2）抗性類型和抗性機(jī)制

       氰霜唑是一種保護(hù)性殺菌劑，通過結(jié)合細(xì)胞色素bcl復(fù)合體中的Qi位點(diǎn)阻斷卵菌線粒體細(xì)胞色素 bcl 絡(luò)合物中的電子傳遞來干擾能量供應(yīng)。它的作用部位是在酶的Qi中心，這種作用機(jī)制不同于其他傳統(tǒng)殺菌劑，包括甲氧基丙烯酸酯類。氰霜唑通過干擾能量供應(yīng)可以阻礙游動(dòng)孢子萌發(fā)、游動(dòng)至孢子囊形成的各個(gè)生育階段，從而達(dá)到預(yù)防和控制病害蔓延的目的。對(duì)霜霉病、晚疫病和十字花科根腫病有。通過在試驗(yàn)中額外添加ATP，降低氰霜唑的藥效，表明氰霜唑的作用方式與ATP能量供應(yīng)系統(tǒng)緊密相連。

       抗藥性檢測(cè)方法

       1.傳統(tǒng)檢測(cè)方法

       葡萄霜霉病對(duì)殺菌劑的抗藥性檢測(cè)方法通常采用傳統(tǒng)葉盤漂浮法，以鮮嫩易感病的葡萄葉片作為試驗(yàn)材料，一般為‘里扎馬特’赤霞珠‘’玫瑰香‘等易感品種，先用1%的次氯酸鈉溶液進(jìn)行消毒，30 s 后用去離子水清洗，然后在超凈工作臺(tái)中用打孔器打成15 mm葉盤，試驗(yàn)過程中將葉盤漂浮在裝有藥液的9 cm培養(yǎng)皿中，每皿10個(gè)葉盤，對(duì)照組采用無菌水代替藥液，根據(jù)發(fā)病情況判斷抗藥性情況。

       甲霜靈目前主要采用此方法進(jìn)行抗藥性檢測(cè)，其普遍使用的標(biāo)準(zhǔn)為敏感檢測(cè)濃度MIC（0.1 μg/mL）作為敏感參考標(biāo)準(zhǔn)用于判斷其他試驗(yàn)的敏感性情況，根據(jù)Stahle-Csech的抗性因子檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，RF > 100即表示產(chǎn)生了抗性，定義當(dāng)MIC=1 μg/mL，RF = 10時(shí)為敏感菌株；當(dāng)MIC = 10 μg/mL，RF = 100時(shí)為低抗；當(dāng)MIC = 100 μg/mL，RF = 1000時(shí)為抗性；當(dāng)MIC ≥ 200 μg/mL，RF ≥ 200時(shí)為高抗。在葡萄霜霉菌對(duì)甲霜靈的抗藥性試驗(yàn)研究中采用兩個(gè)明顯的檢測(cè)濃度標(biāo)準(zhǔn)， MIC為10 μg/mL和100 μg/mL，即菌株在空白對(duì)照組中發(fā)病且在10 μg/mL藥液濃度下未發(fā)病，定義為敏感菌株；在10 μg/mL藥液濃度下發(fā)病但在100 μg/mL藥劑濃度下未發(fā)病的菌株定義為低抗菌株；在100 μg/mL藥劑濃度下發(fā)病的菌株定義為高抗。這套檢測(cè)體系一直作為檢測(cè)甲霜靈抗藥性的標(biāo)準(zhǔn)體系沿用至今。

       嘧菌酯抗藥性檢測(cè)目前有兩種主要的方法，傳統(tǒng)葉盤漂浮法和分子檢測(cè)技術(shù)，在傳統(tǒng)檢測(cè)方法中，根據(jù)Wong等的報(bào)道，葡萄霜霉菌對(duì)嘧菌酯藥劑的EC50值范圍為0.04～0.94 μg/mL，平均EC50 值為0.40 μg/mL。傳統(tǒng)葉盤法進(jìn)行霜霉菌對(duì)嘧菌酯抗性檢測(cè)所用的鑒別濃度為1000 μg/mL，定義菌株在1000 μg/mL藥液濃度下發(fā)病即產(chǎn)生了抗藥性。

       烯酰嗎啉，目前有兩種主要的抗藥性檢測(cè)方法，傳統(tǒng)葉盤漂浮法和分子檢測(cè)技術(shù)。據(jù)Sun等的報(bào)道，葡萄霜霉菌對(duì)烯酰嗎啉的EC50值范圍為0.01 μg/mL到0.21 μg/mL，平均EC50值為0.11 μg/mL，傳統(tǒng)葉盤法進(jìn)行葡萄霜霉菌對(duì)烯酰嗎啉抗性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)濃度為1.6 μg/mL，MIC > 1.6 μg/mL即為抗性個(gè)體，MIC < 1.6 μg/mL為敏感個(gè)體。

       霜脲氰，目前沒有明確統(tǒng)一的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，其作用的方式也尚未知曉，研究中一般主要采用傳統(tǒng)的葉盤漂浮法進(jìn)行抗藥性初步判定。在已報(bào)道的文獻(xiàn)中將參考菌株的MIC值3 μg/mL作為標(biāo)準(zhǔn)參考基線，以此為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定試驗(yàn)菌株的抗性因子，抗性因子大于等于10（RF≥10）即表示產(chǎn)生了抗性；田間用藥的標(biāo)準(zhǔn)參考基線為120 μg/mL，可用此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行田間或者栽培植株整體抗藥性試驗(yàn)。

       氰霜唑，一般作為混劑使用，國(guó)內(nèi)外研究報(bào)道都較少，抗藥性檢測(cè)所使用的方法也只有傳統(tǒng)的檢測(cè)方法。2001年，有研究報(bào)道通過菌絲生長(zhǎng)法測(cè)定疫霉菌對(duì)氰霜唑的EC50值為0.008～0.2 μg/mL，對(duì)游動(dòng)孢子釋放的MIC為0.1 μg/mL。2012年的研究報(bào)道，氰霜唑?qū)苯诽烤也【木z生長(zhǎng)MIC值達(dá)到500 μg/mL，但游動(dòng)孢子囊萌發(fā)試驗(yàn)顯示其EC50值為0.007～0.008 μg/mL。關(guān)于葡萄霜霉病對(duì)氰霜唑的抗藥性相關(guān)研究還較少，其抗藥性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，MIC以及EC50值等目前尚未明確，有待進(jìn)一步探索。

       這些傳統(tǒng)的檢測(cè)方法存在周期長(zhǎng)、效率低、工作量大且穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)。由于葡萄霜霉菌為專性寄生菌，培養(yǎng)條件較為嚴(yán)苛且培養(yǎng)周期較長(zhǎng)，因此采用傳統(tǒng)方法檢測(cè)其抗藥性不僅耗費(fèi)時(shí)間而且其結(jié)果受培養(yǎng)條件和藥劑的質(zhì)量影響較大。隨著殺菌劑的作用方式和抗性機(jī)理不斷被揭示，根據(jù)殺菌劑的抗性機(jī)制，越來越多的分子檢測(cè)技術(shù)被相繼開發(fā)應(yīng)用，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法也逐漸被現(xiàn)代的分子檢測(cè)技術(shù)替代。

       2.分子檢測(cè)技術(shù)

       隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，殺菌劑的作用機(jī)理以及病原菌的抗性機(jī)制相繼被揭示，核酸水平的分子檢測(cè)技術(shù)已成功應(yīng)用于已明確抗藥性突變位點(diǎn)的病原菌田間早期的抗性菌株的快速、準(zhǔn)確檢測(cè)以及監(jiān)測(cè)抗藥性群體的發(fā)展動(dòng)態(tài)等。應(yīng)用此方法的一個(gè)重要前提是殺菌劑的機(jī)制以及病原菌的抗藥性突變位點(diǎn)必須明確清晰，因此，目前該技術(shù)還處于初步發(fā)展階段，許多殺菌劑的機(jī)理以及對(duì)應(yīng)的病原菌抗藥性突變機(jī)制還尚不清晰。

       目前，用于檢測(cè)殺菌劑抗性的分子技術(shù)層出不窮，如突變阻滯擴(kuò)增系統(tǒng)（ARMS）、PCR-RFLP和nested PCR-RFLP技術(shù)、高分辨率溶解曲線（HRM）、環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增法（LAMP）、Tetra-primers ARMS PCR以及Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)等。Aoki等根據(jù)葡萄霜霉菌對(duì)羧酸酰胺類殺菌劑產(chǎn)生抗性后的單核苷酸點(diǎn)突變這一原理，開發(fā)了PCR-RFLP抗藥性分子檢測(cè)技術(shù)，顯著提高了檢測(cè)效率。Zhang等基于葡萄霜霉菌對(duì)烯酰嗎啉抗性突變位點(diǎn)，建立了Tetra-primers ARMS PCR檢測(cè)方法。Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)技術(shù)是一項(xiàng)靈敏度高、特異性強(qiáng)的分子檢測(cè)技術(shù)，MGB分子的存在使得Taqman探針與互補(bǔ)的DNA 鏈結(jié)合更為特異。因此，探針可以識(shí)別出DNA鏈中的單個(gè)堿基變化。郭慶等利用Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)對(duì)葡萄根瘤蚜進(jìn)行檢測(cè)，證明了該方法的特異性，靈敏度可達(dá)1.625拷貝/μL。金麗蘭等利用該技術(shù)分析了YP3A5基因rs776746位點(diǎn)單核苷酸多態(tài)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該技術(shù)對(duì)于CYP3A5 rs776746位點(diǎn)基因型的區(qū)分效率極高，檢測(cè)含量?jī)H為0.01 ng，具有較好的特異性和靈敏度。這些方法各有優(yōu)勢(shì)與缺點(diǎn)，因根據(jù)自身研究的目的合理選擇相應(yīng)的方法。

       展望

       目前，生產(chǎn)上用于防治卵菌的五大類主要內(nèi)吸性殺菌劑中，只有羧酸酰胺類殺菌劑中的烯酰嗎啉和嘧菌酯的病原菌抗性機(jī)制和抗藥性突變位點(diǎn)已經(jīng)明確。常用的檢測(cè)這兩種藥劑抗藥性的方法主要為 PCR-RFLP和Nested PCR-RFLP技術(shù)、Tetra-primers ARMS PCR以及Taqman-MGB探針實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)技術(shù)。對(duì)于甲霜靈、霜脲氰和氰霜唑這三種藥劑其病原菌抗性機(jī)制還在研究探索中。目前，代謝組學(xué)相關(guān)技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于甲霜靈抗藥性的檢測(cè)，通過測(cè)定甲霜靈用藥前后病原菌體內(nèi)各組分的代謝變化來辨別抗性菌株和敏感菌株。