脂肪酶（EC3.1.1.3）又稱三?；视王；饷?，廣泛存在于細(xì)菌、酵母、真菌、植物和動(dòng)物中。由于微生物種類多、繁殖快且微生物脂肪酶一般是胞外酶，因此，微生物脂肪酶是工業(yè)脂肪酶的重要來源。

自然界中大約有2%的微生物產(chǎn)脂肪酶，細(xì)菌脂肪酶大多數(shù)是堿性脂肪酶，pH在4~11、溫度在30~60 ℃之間具有良好的穩(wěn)定性，同時(shí)細(xì)菌脂肪酶多數(shù)是胞外酶，易于液體深層發(fā)酵。目前，細(xì)菌的一些野生菌或重組菌株得到了商業(yè)開發(fā)，其中最重要的是無色桿菌（Achromobacter）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、節(jié)細(xì)菌屬（Arthrobacter）、芽胞桿菌屬（Bacillus）、伯克霍爾德菌（Burkholderia）、色桿菌（Chromobacterium）和假單胞菌屬（Pseudomonas）等。

霉菌脂肪酶的主要包括根霉、曲霉、青霉和毛霉等菌株產(chǎn)的脂肪酶。根霉脂肪酶由于具有高度的sn–1，3 位置特異性和較好的立體選擇性，越來越受到研究者的關(guān)注。目前已經(jīng)克隆出多種根霉脂肪酶基因，并且在多個(gè)表達(dá)系統(tǒng)中獲得表達(dá)。黑曲霉脂肪酶最適底物的脂肪酸碳鏈長(zhǎng)度為C6~C12，具有較高的生物安全性，因此一直作為重要的食品添加劑。

酵母菌主要有皺褶假絲酵母（Candida rugosa）、南極假絲酵母（Candida antarctica）、柱狀假絲酵母（Candida cylindracea）、粘紅酵母（Rhodotorula glutinis）、木糖畢赤酵母（Pichia xylosa）等。

脂肪酶的結(jié)構(gòu)及催化機(jī)理

所有的微生物脂肪酶都屬于α/β水解酶超家族。不同微生物的α螺旋和α螺旋的空間分布、β折疊的數(shù)量和β折疊扭曲角度存在差異，構(gòu)成不同的脂肪酶空間結(jié)構(gòu)。脂肪酶催化酯鍵斷裂可分為4個(gè)階段：底物與酶結(jié)合；瞬間形成四面體中間復(fù)合物；形成穩(wěn)定的共價(jià)中間體復(fù)合物；酰基化合物的釋放。

微生物脂肪酶的活性中心是由 Ser–His–Asp/Glu 組成的催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)，在其周圍還存在 Gly–X–Ser–X–Gly 組成的五肽結(jié)構(gòu)，α/β水解酶折疊結(jié)構(gòu)為脂肪酶的活性位點(diǎn)提供了一個(gè)穩(wěn)定的支架。大多數(shù)脂肪酶具有1個(gè)α螺旋形成的“蓋子”結(jié)構(gòu)，“蓋子”的外表面相對(duì)親水，而內(nèi)表面則相對(duì)疏水，該結(jié)構(gòu)不僅影響酶活性，而且影響酶對(duì)底物的特異性和穩(wěn)定性。

當(dāng)脂肪酶與油–水界面相接觸時(shí)，覆蓋活性位點(diǎn)的α螺旋打開，暴露疏水殘基，增加與脂類底物的親和力，同時(shí)該變化導(dǎo)致脂肪酶在Ser周圍產(chǎn)生親電區(qū)域，可保持催化過程中過渡中間產(chǎn)物穩(wěn)定，使脂肪酶處于活化構(gòu)象。

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的脂肪酶是已知的分子量最小的脂肪酶之一，它沒有α 螺旋構(gòu)成的“蓋子”結(jié)構(gòu)，所以沒有“界面激活”現(xiàn)象。

提高脂肪酶穩(wěn)定性的方法

1、利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)提高脂肪酶的穩(wěn)定性

為了滿足酶需求不斷增加的各類工業(yè)生產(chǎn)，研究者一方面從自然界篩選符合要求的酶，一方面利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)來改造天然酶，使其更好地適應(yīng)工業(yè)應(yīng)用環(huán)境。增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性是蛋白質(zhì)工程技術(shù)研究的重要內(nèi)容。目前利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)提高脂肪酶穩(wěn)定性的策略主要有3種：定向進(jìn)化、理性設(shè)計(jì)以及二者相結(jié)合的半理性設(shè)計(jì)。

定向進(jìn)化（directed evolution）是指首先使用物理/化學(xué)誘變或者易錯(cuò)PCR（error-prone PCR）等方法對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行隨機(jī)誘變構(gòu)建突變體庫(kù)，經(jīng)過高通量篩選得到性能提高的突變體，然后再利用體外重組的方法將這些正向突變進(jìn)行重組，進(jìn)而篩選出目標(biāo)性狀大幅度提高的突變體的方法。定向進(jìn)化通常用于設(shè)計(jì)提高穩(wěn)定性的酶。研究表明，利用定向進(jìn)化手段可以得到穩(wěn)定性顯著提高的突變體脂肪酶。

理性設(shè)計(jì)（rational redesign）是指在較為清楚地了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、功能和相關(guān)性質(zhì)分子機(jī)制的基礎(chǔ)上，先從理論層面上對(duì)蛋白質(zhì)分子中特定氨基酸位點(diǎn)的改變進(jìn)行設(shè)計(jì)，然后利用定點(diǎn)突變的方法在蛋白質(zhì)中引入這些突變位點(diǎn)。利用理性設(shè)計(jì)得到的穩(wěn)定性顯著提高的突變體脂肪酶相較于野生型酶具有更廣泛的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

大量研究數(shù)據(jù)表明控制蛋白質(zhì)某種性質(zhì)的位點(diǎn)可能僅僅局限于序列的某一小部分，例如對(duì)底物的特異選擇性或酶活力取決于活性中心區(qū)域，而酶的穩(wěn)定性等性質(zhì)卻主要和酶的外圍位點(diǎn)或活性中心附近位點(diǎn)密切相關(guān)，因此需要將理性設(shè)計(jì)和定向進(jìn)化結(jié)合：先利用隨機(jī)突變確定決定目標(biāo)性狀的位點(diǎn)，再理性地選定一些位點(diǎn)進(jìn)行重組或飽和突變，進(jìn)一步提高酶目標(biāo)性狀的改造效率，該方法即為半理性設(shè)計(jì)（semi-rational design）。在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)比較和序列比對(duì)的基礎(chǔ)上，再借助計(jì)算機(jī)模擬，可以在很大程度上剔除有害或中性突變，從而實(shí)現(xiàn)在縮小突變體庫(kù)的前提下獲取更多有利突變。

2、利用酶的固定化技術(shù)提高脂肪酶的穩(wěn)定性

酶的固定化是提高脂肪酶穩(wěn)定性的常用策略之一。當(dāng)脂肪酶加入到反應(yīng)介質(zhì)中時(shí)一般是以溶解的狀態(tài)存在，這就難以實(shí)現(xiàn)對(duì)其進(jìn)行回收，此外，在反應(yīng)進(jìn)程中，一些參數(shù)非預(yù)期的變化，例如溫度和 pH 等的變化可能會(huì)導(dǎo)致酶的變性或者失活。然而，大多數(shù)酶在多輪催化反應(yīng)后仍然能保持活性，具有較高的回收利用價(jià)值，回收利用酶的方法之一就是將其固定在不可溶的基質(zhì)上。

此外，固定化酶往往比溶解狀態(tài)的酶有更高的穩(wěn)定性，可以在極端的環(huán)境下發(fā)揮功能且有著更高的轉(zhuǎn)化效率。根據(jù)酶與載體之間的相互作用，酶的固定方法可以分為物理方法和化學(xué)方法。在物理方法中，酶與載體之間主要形成氫鍵和范德華力等較弱且可逆的相互作用；在化學(xué)方法中，酶與載體之間則是通過形成共價(jià)鍵聯(lián)系在一起且不可逆。

物理方法固定脂肪酶包括吸附作用和酶的封裝及誘捕。在吸附固定化方法中，酶分子通過范德華力、疏水相互作用、氫鍵和離子鍵吸附在載體表面，該方法常用的載體為陽(yáng)離子和陰離子交換樹脂、活性炭、硅膠、氧化鋁、可控孔徑玻璃、陶瓷、天然材料如纖維素和瓊脂糖以及一些工業(yè)殘留物。近年來，納米復(fù)合材料的使用因?yàn)槠浣Y(jié)合了各種材料的優(yōu)勢(shì)，成為酶固定的理想材料。吸附固定過程簡(jiǎn)單、成本低，只需要兩步即可完成，因此，該方法是近年來研究最多的脂肪酶固定方法之一。

在封裝固定中，酶保留在有孔徑且允許底物和產(chǎn)物通過的聚合物結(jié)構(gòu)中。與吸附不同，封裝可以避免酶與反應(yīng)體系直接接觸，從而使得由于培養(yǎng)基中溶劑的性質(zhì)引發(fā)的失活效應(yīng)最小化，此外該方法允許酶在相對(duì)長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)保持穩(wěn)定，并且沒有必要從培養(yǎng)基中提取酶；不過，這兩種固定方法的主要問題是難以控制底物和產(chǎn)物在載體內(nèi)擴(kuò)散的孔徑大小會(huì)使酶浸出，且難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的應(yīng)用。

化學(xué)方法固定脂肪酶包括共價(jià)結(jié)合和交聯(lián)。在共價(jià)結(jié)合固定方法中，酶與載體之間以共價(jià)鍵的方式結(jié)合，酶分子的側(cè)鏈氨基酸，即含有有利于形成共價(jià)鍵的官能團(tuán)（羥胺、羧基、咪唑和酚類化合物）的氨基酸殘基，例如賴氨酸、半胱氨酸或天冬氨酸和谷氨酸殘基等與載體材料之間發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成共價(jià)鍵。因?yàn)楣矁r(jià)鍵是一種強(qiáng)的化學(xué)鍵，共價(jià)固定使酶與載體緊密結(jié)合，保證了酶結(jié)構(gòu)的剛性，這種剛性可以保證酶分子的結(jié)構(gòu)在遇到熱、有機(jī)溶劑和極端 pH 等環(huán)境時(shí)不發(fā)生變化，從而保證了其穩(wěn)定性。

不過，共價(jià)結(jié)合也可能改變酶分子的活性中心，從而導(dǎo)致其失活。要避免這種情況的發(fā)生，就需要通過活化反應(yīng)對(duì)載體表面進(jìn)行修飾，提供與酶分子的官能團(tuán)發(fā)生相互作用更活躍的官能團(tuán)。該方法為提高脂肪酶的催化活性和穩(wěn)定性開辟了一條新的途徑，并可能在各種以脂肪酶基礎(chǔ)的工業(yè)過程中具有潛在的應(yīng)用前景。

交聯(lián)固定的過程是由稱為交聯(lián)劑的物質(zhì)完成的，該交聯(lián)劑含有2個(gè)末端，能與溶解酶分子表面氨基酸的特殊基團(tuán)形成分子內(nèi)和分子間交聯(lián)，最終形成交聯(lián)酶。將酶加入含有交聯(lián)劑的媒介中就能形成交聯(lián)酶、交聯(lián)酶晶體、交聯(lián)酶聚合物以及交聯(lián)噴霧干燥酶。由于排除了固體支持物，交聯(lián)酶的主要優(yōu)點(diǎn)是高度催化的酶活性、高穩(wěn)定性和低生產(chǎn)成本。

脂肪酶在食品工業(yè)中的應(yīng)用

1、面食加工

烘焙食品是以面粉、酵母、食鹽、砂糖和水為基本原料，添加適量的油脂、乳品、雞蛋、添加劑等，經(jīng)一系列復(fù)雜工藝手段烘焙而成的方便食品。最近幾十年，研究者開始利用脂肪酶代替烘焙制品中的乳化劑：雙乙酰酒石酸單甘油酯（DATEM）和硬脂酰乳酸鈉（SSL）。

將脂肪酶添加到面包的配方中，可以增加面團(tuán)的柔韌性和產(chǎn)氣量，進(jìn)而增加面包的體積，使面包更加柔軟。脂肪酶還可以與其他酶制劑復(fù)合，從而改變產(chǎn)品的品質(zhì)。如脂肪酶與葡萄糖氧化酶復(fù)配后加入面團(tuán)，能夠提高面包的入爐急脹率，且對(duì)面包芯有二次增白作用。

2、生產(chǎn)類可可脂

由于可可豆的生產(chǎn)受到氣候、地理等條件的限制，可可脂的產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足巧克力生產(chǎn)的需要，因此需要可可脂（Cocoa Butter，CB）的替代品類可可脂（Cocoa Butter Equivalent，CBE）。CBE 具有與CB 非常相似的物理、化學(xué)特性和口感，且與CB 能任意比例混溶。

CB 的脂肪酸的主要組成為棕櫚酸、硬脂酸、油酸和亞油酸，其中 sn–2 位主要的脂肪酸為油酸，含量約為68.7%。特殊的脂肪酸結(jié)構(gòu)決定了類可可脂的生產(chǎn)工藝是以 sn–2 位油酸含量較多的油脂為底物，用棕櫚酸和硬脂酸替代 sn–1，3 位的脂肪酸，可獲得與可可脂類似的脂肪酸構(gòu)型。目前，合成類可可脂的原料主要有棕櫚油、茶樹油、茶樹籽油和烏桕脂等。

3、食品添加劑

油脂和糖酯類食物在人類食譜中占有重要位置，也是人體中一種必須營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高，對(duì)于脂類食物的品質(zhì)要求也逐漸提高，鑒于脂肪酶所具有的位置特異性，人們可以通過改造脂肪酸的構(gòu)成位置來改善脂類食物的各種性質(zhì)。

例如，可以采用改造糖酯脂肪酸碳鏈長(zhǎng)的方法來調(diào)整其親水性，經(jīng)過改造的糖酯可以成為水包油型或油包水型乳化劑，可以作為食品添加劑，具有可降解、無味、無嗅等性質(zhì)，現(xiàn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于食品改良和食品保鮮等領(lǐng)域。

參考資料：

[1]申衛(wèi)家,酈金龍,黎金鑫等.微生物脂肪酶的研究進(jìn)展及其在食品工業(yè)中的應(yīng)用[J].糧食與油脂,2017,30（04）:5-7.

[2]汪玲.微生物脂肪酶的性質(zhì)及應(yīng)用[J].生物化工,2020,6（03）:161-163.

[3]徐碧林,朱慶.微生物脂肪酶穩(wěn)定性研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報(bào),2020,47（06）:1958-1972.

作者簡(jiǎn)介：

小泥沙，食品科技工作者，食品科學(xué)碩士，現(xiàn)就職于國(guó)內(nèi)某大型藥物研發(fā)公司，從事營(yíng)養(yǎng)食品的開發(fā)與研究。